Anotação funcional paralela do câncer

Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 18487 (2022) Citar este artigo

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O uso do sequenciamento do exoma para descoberta de biomarcadores e medicina de precisão requer a conexão da variação no nível de nucleotídeos com alterações funcionais nas proteínas codificadas. No entanto, para anotar funcionalmente as milhares de mutações sem sentido associadas ao câncer, ou variantes de significado incerto (VUS), a purificação de proteínas variantes para análises bioquímicas e funcionais tem custo proibitivo e é ineficiente. Descrevemos a anotação funcional paralela (PFA) de grandes números de VUS usando pequenas culturas e extratos brutos em placas de 96 poços. Usando membros de uma família de histonas metiltransferases, demonstramos anotações estruturais e funcionais de alto rendimento de mutações associadas ao câncer. Ao combinar anotação funcional de parálogos, descobrimos dois parâmetros filogenéticos e de agrupamento que melhoram a precisão das previsões funcionais baseadas em sequência para mais de 90%. Nossos resultados demonstram o valor do PFA para definir funções oncogênicas/supressoras de tumor de metiltransferases de histonas, bem como aumentar a precisão de algoritmos baseados em sequência na previsão dos efeitos de mutações associadas ao câncer.

A anotação funcional de mutações associadas ao câncer é um desafio1,2. A maioria das mutações missense ocorre em posições sem função conhecida, impedindo a identificação de mutações de motorista versus neutro (passageiro). Os métodos atuais de anotação funcional usam a conservação da sequência de nucleotídeos e aminoácidos (aa) para prever a patogenicidade mutacional3,4,5. A validação depende da divergência mutante nas cadeias laterais aa em comparação com o tipo selvagem e estima estatisticamente a probabilidade de seleção positiva em relação à taxa de mutação de fundo6. No entanto, alterar um aa conservado nem sempre altera a função. Algoritmos que incorporam informações estruturais e termodinâmicas em previsões funcionais7,8 são limitados pela escassez de informações estruturais para estados conformacionais e ligantes de proteínas. Prever o impacto da substituição de aa na função é difícil para proteínas em complexos. As previsões melhoram para proteínas bem caracterizadas, mas essas informações requerem purificação e caracterização de proteínas caras e demoradas. Saber quais mutações conduzem ao câncer é crucial para priorizar estudos baseados em células e animais, mas os programas de previsão funcional não podem orientar de forma confiável esses experimentos de alto custo6,9.

Descrevemos a anotação funcional paralela (PFA) para caracterização de alto rendimento de variantes missense associadas ao câncer de significado incerto (VUS) sem purificação de proteínas. Demonstramos o valor do PFA com três metiltransferases da família da Leucemia de Linhagem Mista (MLL) histona H3 lisina 4 (H3K4) que estão entre os genes mutados com mais frequência no câncer (Fig. S1A)10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20. Mutações nas enzimas da família MLL estão associadas a aberrações em todo o genoma nos padrões de metilação H3K4, que estão ligadas a programas transcricionais anormais que promovem malignidade18,21,22,23. De centenas de MLL1-3 VUS, a maioria está em posições de aminoácidos sem função conhecida (Fig. S1B). Nós rastreamos 99 mutações missense associadas ao câncer em ou ao redor dos domínios catalíticos Suppressor of Variegation, Enhancer of Zeste, Trithorax (SET), comparando os resultados com dois programas de predição funcional amplamente utilizados. Usando a anotação funcional de três parálogos MLL, descobrimos que a combinação de dois parâmetros filogenéticos e de agrupamento melhorou a precisão da previsão funcional baseada em sequência para > 90%. Esses resultados fornecem uma base para melhorar os métodos computacionais para prever efeitos funcionais de mutações associadas ao câncer para descoberta de biomarcadores e medicina de precisão.

Para entender melhor como as ferramentas preditivas categorizam as mutações missense clinicamente relevantes em famílias de enzimas frequentemente mutadas, analisamos funcionalmente o VUS nos domínios SET catalíticos de MLL1-3 (Fig. 1), comparando os resultados com três programas de predição computacional amplamente utilizados. As enzimas MLL catalisam a metilação da histona H3 lisina 4 (H3K4)24. As alterações estão associadas a aberrações genômicas na metilação ligadas à malignidade. MLL1-3 estão entre os genes mais comumente mutados em vários cânceres25,26. De centenas de MLL1-3 VUS, a maioria está em posições de aminoácidos sem função conhecida (Fig. S1).